《夜行书生》以朝鲜时代为背景，因家族蒙冤而没落的官宦之女杨仙，为谋生女扮男装，化名“杨仙”在街头卖书。某夜，她遇见一位容颜绝世却行踪诡异的神秘书生金圣烈，两人因书结缘，渐生情愫。然而圣烈隐藏着一个惊人的秘密——他是活了百年的吸血鬼，但从不滥杀无辜，只以恶人之血维生，默默守护着王朝。随着杨仙深入宫廷书库，她逐渐发现宫中暗藏着一股邪恶势力：以白毛鬼为首的吸血鬼集团掌控着王权，企图利用“鬼书”掌控天下。圣烈为守护杨仙与百姓，与白毛鬼展开殊死对抗。与此同时，世子李允也在追查父亲暴毙的真相，与杨仙、圣烈结为同盟。在阴谋与爱情交织中，杨仙得知圣烈因她的血而获得力量，两人命运紧密相连。最终，圣烈拼尽全力击败白毛鬼，杨仙也坦然接受爱人的真实身份，以人类之躯陪伴永生之人，谱写了一曲跨越种族的生死悲歌。